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單克隆抗體技術:細胞的選擇

放大字體  縮小字體 發布日期:2006-06-28

脾細胞

1.材料

(1) 免疫過的血清抗體滴度高的Balb/c鼠。

(2) 1640培養液

(3) 2.5%FCS-1640營養液

2.操作方法

(1) 拉頸或用CO2處死小白鼠。

(2) 將小鼠放于70%酒精中浸泡消毒,取出固定于板上,在無菌條件下取脾。

(3) 把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液中,冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球。

(4) 用鑷子輕輕擠壓脾,做成脾細胞懸液,用毛細管將懸液移入小試管中。

(5) 直立小試管3min,使大塊的結締組織下沉,把細胞懸液移入離心管中。

(6) 以2.5%FCS—1640充滿離心管,并以400g離心7min~10min(與此同時應開始制備骨髓細胞)。

(7) 把沉淀用約10ml的新鮮培養液再懸浮。

(8) 重復⑹、⑺步驟。

(9) 計算細胞,以臺盼蘭染色用相差顯微鏡檢查,活細胞數應高于80%為合格。


骨髓瘤細胞

骨髓瘤細胞能產生并分泌大量的免疫球蛋白,這樣的瘤細胞融合后,可能影響或降低所分泌抗體的滴度,所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細胞。

選擇骨髓瘤細胞的條件:①該瘤細胞系的來源應與制備脾細胞小鼠為同一品系,以便兩者的組織相容性抗原一致;②骨髓瘤細胞必須是靜息狀態,不產生γ球蛋白或不分泌到細胞外;③骨髓瘤細胞生長需要一個較高的細胞密度,最好106個細胞/ml;④生長速度快,繁殖時間短。

目前常用的Balb/c小鼠產生的骨髓瘤細胞株有:①S194/5XXO·BU·1;②SP2/0—Ag14(簡稱SP2);③P2—X? ­—Ag8·6·5·3(簡稱653);④FO

以653最為常用,它是由礦物油4-甲基-15烷(Pristane,降植烷)誘發出來的一種漿細胞瘤(Minerol Oil plasmacy toma,MOPC)并經過培育形成一株8-氮鳥嘌呤有抵抗力的亞系。

骨髓瘤細胞一般由有關單位直接引入,保存于-195℃液氮罐中,試驗時復蘇、增殖、傳代即可。

由于骨髓瘤細胞是半貼壁狀態,很容易脫落,因此不需要胰酶處理。為了防止出現返祖現象,在融合前,可將培養基內加入15μg/ml 8-氮鳥嘌呤。取約1×107~6×107對數生長期(即培養15h~20h)的骨髓瘤細胞,在室溫離心(400g)10min,沉淀以2.5%FCS—1640液再懸浮并計數。


飼養細胞

在體外的細胞培養中,單個的或數量很少的細胞不易生存與繁殖,必須加入其它活的細胞才能使其生長繁殖,加入的細胞稱之為飼養細胞(Feeder cell)。在細胞融合和單克隆的選擇過程中,就是在少量的或單個細胞的基礎上使其生長繁殖成群體,因此在這一過程中必須使用飼養細胞。許多種類的動物細胞都可以做飼養細胞,如正常的脾細胞、胸腺細胞、腹腔滲出細胞等,常選用腹腔滲出細胞,其中主要是巨噬細胞和淋巴細胞。應用腹腔滲出細胞的好處是:一方面做飼養細胞,另一方面巨噬細胞可以吞噬死亡的細胞和細胞碎片,為融合細胞的生長造成良好的環境。腹腔細胞的來源可以是與骨髓瘤細胞同系鼠。也可以是其他種類的小鼠,如C57鼠,昆明小白鼠等。

1.材料

(1)小鼠(Balb/c或C57小白鼠)若干只。

(2)11.6%蔗糖溶液(經10磅30min高壓滅菌)。

2.操作方法

(1)拉頸處死小鼠。

(2)70%酒精浸泡消毒10min。

(3)用手術剪將小鼠腹部剪開一小口,剝開皮膚,露出腹腔。

(4)用注射器將4ml 11.6%蔗糖溶液注入腹腔,用手指輕揉1min仍用該注射器回抽腹腔液體,加入離心管。

(5)1 000r/min離心10min。

(6)取上清,以HAT選擇培養液將細胞制成懸液。臺盼藍染色計數活細胞,使每毫升含40萬個活細胞。

(7)以1ml吸管將細胞種入微量培養皿,每孔0.05ml,含2萬個細胞,放入CO2培養箱培養,即可供細胞融合和克隆化之用。如果在融合后發現在培養孔中飼養細胞數量少,則可以在細胞換液時再加入一些。

 
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