在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此必然帶來一些特殊的問題，我們必須充分地重視。

 

1、要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相。有些溶劑在一定的比例內(nèi)互溶，超出一定的范圍后就不會(huì)互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸銨（pH5.16）做梯度洗脫，乙腈含量超過70%時(shí)就會(huì)出現(xiàn)不溶，甲醇和已烷混合，甲醇含量高于30%時(shí)就會(huì)分層等。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖溶液混合時(shí)還可能析出鹽的結(jié)晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心。

 

2、梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證好的重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辯認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭上后會(huì)被強(qiáng)的溶劑洗脫出來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止溶劑混合時(shí)產(chǎn)生氣泡。

 

3、混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因此在梯度洗脫時(shí)常會(huì)出現(xiàn)壓力變化，例如純水或甲醇的粘度都比較小，但是當(dāng)二者以相近的比例混合時(shí)粘度會(huì)增大很多，此時(shí)的柱壓是純水或甲醇為流動(dòng)相時(shí)的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱所能承受的最大壓力。

 

4、每次梯度洗脫之后必須對(duì)色譜柱進(jìn)行再生處理，使其恢復(fù)到初始的狀態(tài)。需讓10～30倍柱容積的初始流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動(dòng)相達(dá)到完全平衡。