① 引物：如果引物設(shè)計不優(yōu)，如引物設(shè)計軟件得出的引物評分較低、引物擴(kuò)增效率不滿足90-110%，主要原因可能是引物本身質(zhì)量不佳導(dǎo)致體系出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。

解決方案：

重新設(shè)計引物，選擇引物設(shè)計軟件評分較高的2-3對引物進(jìn)行合成，之后選擇融解曲線無雜峰，擴(kuò)增效率滿足90-110%，且更接近100%的引物作為該基因的引物。

若該雜峰為引物二聚體引起，適當(dāng)降低引物的投入量可以有效抑制引物二聚體的產(chǎn)生。

② 模板：cDNA模板存在基因組污染。

解決方案：

設(shè)計跨內(nèi)含子引物進(jìn)而避免基因組污染帶來的干擾；或者選用帶有基因組清除的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄前對RNA中混有的基因組進(jìn)行清除。

③ C_T值偏大：C_T值≥30，可能是由于基因本身表達(dá)量低、或者擴(kuò)增效率不滿足90-110%而導(dǎo)致的基因C_T值偏大。C_T值較大的情況下，融解曲線容易出現(xiàn)雜峰。