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BIOXL 豬口蹄疫亞O型一步法熒光RT-PCR診斷試劑盒說明書

放大字體  縮小字體 發布日期:2009-03-04  瀏覽次數:1167
核心提示:包括 48 個擴增反應所需的試劑 請在使用前通讀操作說明書 1. 試劑盒組成 25 管 擴增反應試劑球 (Reagent Sphere; 4oC 保存) 2 x 520 l FMDVA-1 擴增反應試劑球溶液 (Sphere Diluent; -20oC 保存) 2 x 25 l 陽性對照 (Positive control; -20oC 保存) 1 x 10l Taq酶(Taq
包括48 個擴增反應所需的試劑
請在使用前通讀操作說明書
1. 試劑盒組成
■ 25 管 擴增反應試劑球 (Reagent Sphere; 4oC 保存)
■ 2 x 520 μl FMDVA-1 擴增反應試劑球溶液 (Sphere Diluent; -20oC 保存)
■ 2 x 25 μl 陽性對照 (Positive control; -20oC 保存)
■ 1 x 10μl Taq酶(Taq Polymerase; -20oC 保存)
 
保存條件
試劑球需置干燥劑中保存在4oC,已融解的試劑球則需保存在零下20oC。其他試劑需保存在零下20oC。使用前在冰上溶解各試劑并充分混合,不要旋渦振蕩含酶的擴增反應試劑。
 
2. 操作程序
 
擴增反應試劑的準備
1. 計算所需的反應數量 (n)
2. 需要溶解的試劑球 = 0.5 x n
3. 每個試劑球需要 40 μl 試劑球溶液及0.4μl Taq酶。
4. 在冰上溶解試劑,并輕輕扣擊充分混合 (不要旋渦振蕩含酶的試劑)
 
反應的準備
1. 實驗中除從樣本中獲得的RNA 模板外,我們還建議設置陽性和陰性(水)對照
2. 按照下表準備擴增反應試劑:
 
反應組分
每個反應體積
擴增反應試劑
20 μl
樣品RNA
5 μl
總體積
25 μl
 
注意:
■ 實驗時 RNA 應放在冰上
■ 陽性對照建議加5 μl 試劑盒提供的陽性對照。
■ 建議PCR 過程中檢測樣本設置重復,以便得到可靠的實驗結果
■ 為了驗證陰性實驗結果不是由于樣本中存有PCR 抑制物而導致PCR 呈陰性反應,我們建議在測試樣本中加1 μl 的陽性對照作為spiking 對照 (spiking control),同時進行PCR 反應。
 
 
 
PCR 循環:
                                             數據收集位點(FAM染料)
                                      ABI7700       ABI7300        其它儀器
1 個循環    42oC  30 分鐘                 *
95oC  10 分鐘                 *
5 個循環    95oC  10 秒                   *
45oC  30 秒                   *
72oC  60 秒                   *
40 個循環   95oC  15 秒                   *
58oC  60 秒                   *              *              *
                                                       ( * 表示位點收集FAM讀數)
 
 
3. 實驗數據分析
陰性的實驗結果有幾個可能性:
1. 樣本中不存在目的片段;
2. 樣本中目的片段的量低于檢測值;
3. 樣本中存有 PCR 抑制物。
試劑盒中設計spiking 對照 (spiking control) 是為了確定沒有發生PCR 抑制。
如果樣本中加了陽性對照以后擴增結果的Ct值接近40(或者接近陰性對照的Ct值),說明樣本中存在PCR 抑制物,那幺此次陰性的實驗結果就不能作為正確的結果,需要重新開始樣本核酸的提取和PCR 擴增。

    北京祥龍環宇生物技術有限公司
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    電話 010-65567512   傳真010-65563420
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