序列測定(sequencing)已有50多年的歷史，但開始時進展十分緩慢。最初，人們致力于建立蛋白質(proteins)和多肽(peptides)的分離技術，并確定其氨基酸(amino acids)種類及含量。1945以前，沒有任何蛋白質序列定量測定的方法。以后十年中，隨著色譜技術和標記方法的快速進展，第一個多肽激素(胰島素)的全序列測定于1955年完成(Ryle等，1955)。五年后，第一個酶(核糖核酸酶)序列測定完成(Hirs等，1960年)。1965年，約有20個含100多個殘基的蛋白質序列被確定。截止1980年，這一數字已達1500個。而今天，已測定的蛋白質序列已達30萬個，這在50年前是難以想象的。
最初，蛋白質序列測定主要采用手工的埃德曼降解和環甲基化(Edman deglation - dansylation)方法(Edman，1950年)。蛋白質序列測定的快速進展，應該歸功于自動測序儀的研制成功。與埃德曼和貝格(Begg) 于1967年發明的測序法相比，1980年開始使用的自動測序儀的靈敏度提高了近1萬倍。
質譜技術的發展為蛋白質序列測定開辟了新的途徑。第一次用這種方法測定完整的蛋白質分子是在1997年。質譜法測序的突出優點是可以識別翻譯后修飾 (post-translations modification) 而得到的特殊氨基酸。用其它方法進行蛋白質序列測定時，這種修飾信息無法獲得。正是利用了質譜技術，人們得出了 g-氨基丁酸處于凝血素N-末端的重要結論。