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反向PCR

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01

反向PCR(reverse PCR)是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的未知序列的片段,而常規(guī)PCR擴(kuò)增的是已知序列的兩引物之間DNA片段.實(shí)驗(yàn)時選擇已知序列內(nèi)部沒有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對該段DNA進(jìn)行酶切,然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接,再用一對反向的引物進(jìn)行PCR,其擴(kuò)增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列,從而對未知序進(jìn)行分析研究.
  反向PCR的目的在于擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的DNA,也就是說這一反應(yīng)體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列,因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。這時選擇的引物雖然與核心DNA區(qū)兩末端序列互補(bǔ),但兩引物3’端是相互反向的。擴(kuò)增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA,然后用DNA連接酶連接成一個環(huán)狀DNA分子,通過反向PCR擴(kuò)增引物的上游片段和下游片段;現(xiàn)已制備了酵母人工染色體(YAC)大的線狀DNA片段的雜交探針,這對于轉(zhuǎn)座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA片段序列的識別十分重要。

  該方法的不足是:①需要從許多酶中選擇限制酶,或者說必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點(diǎn)切斷靶DNA。②大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列,而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時也會有這些序列,這樣,通過反向PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。

  利用反向PCR可對未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,探索鄰接已知DNA片段的序列,并可將僅知部分序列的全長cDNA進(jìn)行分子克隆,建立全長的DNA探針。適用于基因游走、轉(zhuǎn)位因子和已知序列DNA旁側(cè)病毒整合位點(diǎn)分析等研究。


 
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