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反向PCR程序

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01
用傳統(tǒng)的緩沖液和其他提供者推薦的條件裂解DNA。反向PCR所擴(kuò)增的片段的大小由 PCR擴(kuò)增片段的大小決定,目前,PCR擴(kuò)增的實(shí)際上限為3-4kb。在許多情況下,首先 需要進(jìn)行Southern雜交來確定內(nèi)切酶用以產(chǎn)生大小適于環(huán)化及反向PCR的片段的末端 片段。能裂解核心區(qū)的內(nèi)切酶使反向PCR只能擴(kuò)增引物所定模板(依賴于引物)的上游 或上游區(qū),而不裂解核心區(qū)的酶則使兩上邊側(cè)序列都擴(kuò)增,并帶有由內(nèi)切酶和環(huán)化類 型決定的接點(diǎn)(例如,互補(bǔ)突頭連接與鈍頭連接)。對(duì)于擴(kuò)增左翼或右翼序列,初試時(shí) 最好靠近識(shí)別上個(gè)堿基位位的酶,并已知在核心區(qū)有其方便的裂解位點(diǎn)。如果用反向 PCR從含有大量不同的克隆片段的同一載體中探測(cè)雜交探針,建議事先在載體中引入 合適的酶切位點(diǎn)。
  用T4連接酶在稀DNA濃度下環(huán)化更容易形成單環(huán)。在一些實(shí)驗(yàn)中,為產(chǎn)生對(duì)反向 PCR大小適當(dāng)?shù)腄NA片段需要兩種內(nèi)切酶,但這樣所產(chǎn)生的片段末端則不適于連接,環(huán) 化前需用Klenow或噬菌體T4DNA聚合酶修理(鈍化)。連接前,需用酚或熱變性使內(nèi)切 酶失活。
  聚合酶鏈反應(yīng)條件與經(jīng)典所用的相同,例如,94℃-30秒變性,58℃-30秒引物退火, Taq聚合酶70℃延伸3分鐘,進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。可改變PCR條件以生產(chǎn)特異產(chǎn)物。將反向 PCR用于測(cè)序時(shí),與核心區(qū)末端后部結(jié)合的擴(kuò)增引物更為有用,它使測(cè)序引物擴(kuò)增部 分的核心序列與未知邊側(cè)序列間的接點(diǎn)更近,減少了擴(kuò)增引物的干擾。
 
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