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質(zhì)粒DNA的大量制備

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-02
    (1)將2ml含相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基加入到通氣良好的15ml的試管中,接入一單菌落,于37℃劇烈振蕩培養(yǎng)過夜。
  (2)將1ml含菌液倒入含相應抗生素的Lb 100ml中,37℃振蕩培養(yǎng)至A590=1.0(5~6h)。
  (3)加氯霉素(170μg/ml)擴增,37℃溫箱中培養(yǎng)過夜。
  (4)收集菌液于離心管中,冰浴10min。3000rpm,離心10min,去上清。
  (5)加溶液Ⅰ5ml懸浮菌體,將懸液倒入高速離心管中,搖勻,冰浴5min。
  (6)加溶液Ⅱ10ml輕輕混勻,室溫下5min。
  (7)加溶液Ⅲ7.5ml輕輕混勻,冰浴30min。15000rpm,4℃離心20min。
  (8)取上清液于高速離心管中,加2倍體積的無水乙醇,混勻,入-20℃3~5h。
  (9)15000rpm 4℃ 離心20min。
  (10)棄上清,將離心管倒放入真空泵中抽干(10~15min)。
  (11)用5ml1×TE溶解,加入RNase A 15~20μl,42℃水浴4h于過夜。
  (12)加入5ml飽和酚,混勻,4000~5000rpm離心5min,取上清液入5ml離心管內(nèi)。
  (13)分別加入2.5ml飽和酚,2.5ml氯仿,混勻后同樣離心收集上清。
  (14)加等體積氯仿/異戊醇(24:1)混勻,同樣離心收集上清。
  (15)加入1/10體積的3mol/l NaAc及2倍體積的無水乙醇于-20℃3~5h。
  (16)10000rpm 4℃離心20min。
  (17)棄上清,加入75%乙醇洗滌2次。
  (18)離心棄上清,真空抽干,加入適量1×TE溶解質(zhì)粒DNA。
 
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