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白細(xì)胞DNA的制備

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-05
    (1)采集外周靜脈血10ml,加1.7ml ACD(檸檬酸0.48g、檸檬酸鈉1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml,0.6kg/cm2滅菌30min)抗凝。
  (2)將血液放入已滅菌的50ml塑料離心管內(nèi),加30mlSTMT[0.32mol/L蔗糖、10mmol/l Tris-HCl(pH7.5)、5mmol/L MgCl2、1%Triton –X 100],輕輕上下振蕩至透明,紅細(xì)胞完全溶解。
  (3)冰浴10min,離心,3000rpm,10min。棄上清,STMT重復(fù)處理1~3次。
  (4)棄上清,白色沉淀物加10ml STE[0.1mol/L NaCl、10mmol/l Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)],先少量,充分混勻,然后加10mg/ml蛋白酶K100μl,20%SDS30μl,搖勻,置37℃水浴15~20h。
  (5)用等體積飽和酚抽提,3000rpm離心5min。
  (6)用大口鈍緣吸管小心吸取上層水相,加飽和酚和氯仿-異戊醇(24:1)抽提,3000rpm離心5min 。
  (7)小心吸取上層水相,用等體積氯仿-異戊醇(24:1),抽提,3000rpm離心5min。
  (8)小心吸取上層水相,加入1/10體積3mol/l NaAc,2.5體積預(yù)冷無水乙醇混勻,-20℃過夜。
  (9)將白色絮狀沉淀物用玻璃棒挑出,放入Eppendorf管內(nèi),加1ml 75%乙醇4℃靜置1h,離心,10000rpm 10min。
  (10)棄上清,用蠟?zāi)⒐芸诜夂茫槾虜?shù)個小孔,真空抽提(10~15min)。
  (11)加200μl 1×TE溶解,置4℃保存。
  (12)對所提DNA用紫外分光光度計進(jìn)行定量和純度檢測。
  (13)取2~4μl DNA樣品,經(jīng)瓊脂糖凝膠(Agarose)電泳,檢查所提DNA的質(zhì)量及降解情況。
 
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